Обіймав посади володимирського старости та маршалка волинської шляхти (від 1550), сенатора (1569). На посаді київського воєводи (від 1559) був фактичним господарем українського прикордоння або «некоронованим королем Русі».
У 1581 р. на кошти князя було видано перший текст Біблії (Острозька Біблія) церковнослов’янською мовою.
На початку 90-х рр. XVI ст. висунув програму об’єднання католицької та православної церков на засадах рівності. Водночас виступив проти укладення церковної унії в тій формі, яку запропонували її учасники. Очолив опозицію на антиунійному Берестейському церковному соборі. Надіслав офіційний протест королю Речі Посполитої та уклав антикатолицький союз із польськими протестантами, погрожуючи підняти повстання.
Відомий своєю меценатською діяльністю. Заснував початкові школи в Турові (1572), Володимирі-Волинському (1577) при Києво-Печерському монастирі, у Слуцьку, колегію в Острозі (бл. 1576–1580), а також друкарні в Острозі, Дерманському і Києво-Печерському монастирях.
Висувався претендентом на польську корону після смерті Сигізмунда II Августа (1572) і московський престол після смерті царя Федора Івановича (1598).
Завдяки турботі й матеріальній підтримці князя в Києві були відбудовані Кирилівський і Межигірський монастирі, на Подолі збудовано церкви Миколи Доброго і Різдвяно-Передтечинська. Вважається, що він був патроном понад тисячі православних церков в Україні.
Не підтримав укладення Люблінської унії. Вважав, що Україна має увійти третім рівноправним суб’єктом, як Польща і Литва, до складу Речі Посполитої. Підписав унію лише під загрозою втрати маєтностей.
Наприкінці XVI ст. був найбільшим після короля землевласником Речі Посполитої. Мав землеволодіння на Волині, Поділлі, Київщині, у Галичині та польських воєводствах. Щороку прибутки князя (10 млн золотих) складали два річні бюджети Речі Посполитої.
Брав участь у придушенні повстань під проводом К. Косинського і С. Наливайка.
