Цифрова мікроскопія на відміну традиційної світлової мікроскопії дає можливість, окрім безпосереднього спостереження об'єктів екрані монітора, документувати інформацію в електронному вигляді, тобто робити цифрові фотографії, а також записувати відео.
Технічно замість окуляра світлового мікроскопа за допомогою спеціального адаптера розміщується спеціальна цифрова відеокамера високої роздільної здатності. Важливо, щоб камера була «швидка», тобто відображала інформацію на екрані без гальмування та практично без затримки.
Для прикладу, цифрова камера Digital Sight 10 може передавати зображення 6000×3984 пікселів зі швидкістю 9 кадрів за секунду. Фото Digital Sight 10 наведено нижче, а більше інформації про цю камеру можете дізнатися за посиланням.
Класичний світловий мікроскоп складається з об'єктиву та окуляра. Об'єктив збільшує розмір об'єкта, що спостерігається, а окуляр «розглядає» вже збільшене об'єктивом зображення, направляючи в око паралельний пучок світла. Таким чином, оптичне збільшення світлового мікроскопа – це витвір (перемноження) збільшення об'єктива та окуляра. Наприклад, об'єктив збільшує в 40 разів, а окуляр – в 10 разів, сумарне збільшення мікроскопа 400 разів.
Як працює цифровий мікроскоп?
У разі цифрового мікроскопа роль ока людини грає камера, а роль сітківки ока, куди проектується зображення, відіграє світлочутлива матриця камери. Зображення сфокусоване на матрицю камери транслюється на екран монітора. І вже з екрана монітора ми можемо бачити картинку безпосередньо на власні очі. Таким чином, спочатку роль людського ока як приймача оптичної інформації відіграє камера. Тоді за аналогією з оптичним збільшенням візуальне збільшення на екрані монітора є добуток (перемноження) збільшення об'єктива і власного збільшення камери. Наприклад, якщо об'єктив має збільшення 40х, а власне збільшення камери 50х, загальне візуальне збільшення на екрані монітора виходить 2000х.
Не слід плутати візуальне збільшення на екрані монітора із оптичним збільшенням мікроскопа. Збільшення мікроскопа насамперед визначається об'єктивом мікроскопа. Об'єктив має таку характеристику як числова апертура. Величина числової апертури вказується на об'єктиві через слеш після збільшення. Наприклад, якщо на об'єктиві зазначено 100/1.25, це означає, що числова апертура об'єктива даного порядку 1.25. Так ось максимально досяжне корисне оптичне збільшення мікроскопа дорівнює тисячоразово взятій числовій апертурі, тобто. у прикладі – 1250 раз (для даного об'єктива). Ця величина обмежується фундаментальними законами дифракції світла і може бути змінена істотно видимого діапазону світла (весь спектр веселки).
Може виникнути питання, як цифровими методами візуалізації досягається збільшення більше, ніж 1250 разів (для 100х об'єктива). Наприклад, якщо візуальне збільшення на екрані монітора становить 4000 разів (для 100 об'єктива), це означає, що зображення на матриці камери проектується з деяким запасом пікселів за роздільною здатністю, щоб усі найменші об'єкти та деталі були якомога дрібніше відбиті. Тобто. мікроскопічна точка, дозволена об'єктивом, проектується не так на один піксель матриці камери, але в три чи чотири, що дозволяє його краще візуалізувати і розглянути.
Таким чином, спостерігаючи об'єкти на екрані монітора з високою візуальною роздільною здатністю, навіть перебуваючи на якійсь відстані від нього, спостерігач може точно зафіксувати цю мікроскопічну точку. А от якби ця точка спостерігалася просто в окуляри світлового мікроскопа, то, зважаючи на її мікроскопічність, вона могла б вислизнути з поля зору. Ну, або принаймні спостерігачеві потрібно було б докладати чималих зусиль, щоб зафіксувати візуально даний мікроскопічний об'єкт.
Отже, надбавкове збільшення (все, що понад корисне оптичне збільшення) дозволяє просто комфортно і більш точно фіксувати дрібні об'єкти за допомогою цифрових систем візуалізації. Таким чином, наприклад, «стрибуючі точки» (ліпіди, бактерії) в плазмі крові, які важко видно в окуляри простого світлового мікроскопа, вдається легко фіксувати цифровими методами візуалізації в мікроскопії.
Особливості зображення
Однак треба розуміти, що якщо ми за допомогою цифрового проектора сфокусуємо зображення на стіну будинку, і отримаємо візуальне збільшення, допустимо в 100 000 разів, це не означає, що ми побачимо якісь нові дрібні об'єкти. Розглядаючи еритроцити крові, ми не побачимо на стіні їх «ручок-ніжок-очіків». Надбавкове збільшення не відкриває нових деталей, воно лише дозволяє зручніше візуалізувати досліджувані об'єкти. А надто високе надбавкове збільшення веде до зменшення чіткості та розмаїття. Даний приклад з проектуванням на стіну може бути актуальним лише якщо спостерігач знаходиться на великій відстані від стіни.
Отже, платою за зручність спостереження є зменшення чіткості та розмаїття. Нікуди тут не дінешся. Чудес не буває (бувають, але не тут). Надбавне збільшення є корисним лише у невеликій кількості. За умови спостереження об'єкта, що досліджується, на відстані одного метра від монітора, допустиме корисне надбавкове збільшення повинно бути не більше 4-5 разів більше корисного оптичного збільшення. Тобто якщо використовується об'єктив 60х з апертурою 0.85 (корисне оптичне збільшення при цьому буде 850х), то візуальне збільшення на екрані монітора не повинно перевищувати 4000-5000 разів. Насправді власне збільшення камери для монітора 15″ (16:9) варіюється не більше 40х...60х (залежно від моделі камери і форм-фактора матриці), відповідно візуальне збільшення на екрані монітора для об'єктива 60х буде відповідно 2400х... 3600х.
Є ще один нюанс
Зі зростанням збільшення мікроскопа зменшується поле зору. Взагалі величина поля зору та збільшення мікроскопа – обернено пропорційні величини. Тобто якщо ми хочемо добре бачити дрібні деталі об'єкта дослідження, тих самих, наприклад, еритроцитів при 100-х об'єктиві, то при цьому ми бачитимемо на екрані всього 3-5 штук еритроцитів. Але вони будуть великі, добре деталізовані. І навпаки, якщо еритроцити маленькі, наприклад, при спостереженні з об'єктивом 10х, їх може поміститися на площі екрана близько 300-500 штук, тоді дрібних деталей кожного еритроциту звичайно ж не видно, зате можна побачити загальну картину розташування еритроцитів по краплі крові, скупчення, конгламерати, різні включення та інше.
При роботі з цифровим мікроскопом слід підібрати збільшення шляхом зміни об'єктива мікроскопа, щоб загальне візуальне збільшення на екрані монітора було досить високим для дозволу дрібних деталей еритроцитів, але поле зору у своїй має залишатися досить широким спостереження ситуації загалом за протяжністю досліджуваного об'єкта.
Наприклад, для мікроскопії нативної крові при спостереженні ситуації в цілому використовується об'єктив 10х або 20х, а для дослідження структури формених об'єктів крові (еритроцити, лейкоцити, включення та ін.).) дуже добре зарекомендував себе об'єктив 60-х. Якщо необхідно отримати детальне дослідження окремих об'єктів, тоді використовують імерсійний об'єктив 100х. Інший популярний об'єктив, який стандартно поставляється з мікроскопами, 40х у мікроскопії нативної крові є певним компромісом між роздільною здатністю і великим полем зору. Але для структурного аналізу його збільшення все ж таки недостатньо.
